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食品微生物檢驗(yàn)GB4789.5-2012 志賀氏菌檢驗(yàn)及注意事項(xiàng)

發(fā)布時(shí)間：2020-11-18      瀏覽次數(shù)：20997    分享：

一、志賀氏菌的生物學(xué)特性

生物學(xué)特性：志賀氏菌屬細(xì)菌為革蘭氏陰性短桿菌，長約2～3μm，寬0.5～0.7μm，無芽胞，無莢膜，無鞭毛，有菌毛，不運(yùn)動(dòng)；需氧或兼性厭氧，對(duì)營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基（如營養(yǎng)瓊脂）上即能生長；最適生長溫度35~37℃，適宜pH為6.4~7.8。發(fā)酵糖類產(chǎn)酸不產(chǎn)氣(福氏和鮑氏志賀菌中的某些血清型偶可產(chǎn)生少量氣體)。分為4個(gè)群：A群（痢疾志賀氏菌）、B群（福氏志賀氏菌）、C群（鮑氏志賀氏菌）、D群（宋內(nèi)氏志賀氏菌）。

流行學(xué)特征：志賀氏菌產(chǎn)生強(qiáng)烈的內(nèi)毒素（endotoxin，ET），是一種脂多糖和脂蛋白復(fù)合物，為志賀氏菌致病的重要致病因素。A群志賀氏菌Ⅰ型能產(chǎn)生一種毒性極強(qiáng)的細(xì)菌外毒素稱為志賀毒素（Shigatoxin，Stx），與感染者中毒性腹瀉、出血性腸炎、溶血性尿毒癥等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)，其毒性可表現(xiàn)為神經(jīng)毒性、細(xì)胞毒性和腸毒性。在我國以福氏和宋內(nèi)志賀菌引起的菌痢最為常見。 病人和帶菌者是細(xì)菌性痢疾的傳染源，由于飲食從業(yè)人員的帶菌，可以使食品污染而造成食物型爆發(fā)。由于污水滲入供水系統(tǒng)，也常造成水型的爆發(fā)。

二、志賀氏菌的檢驗(yàn)

三、培養(yǎng)基原理解析

1. 志賀氏菌增菌肉湯培養(yǎng)基

?培養(yǎng)基中除胰蛋白胨、葡萄糖外，加入新生霉素作抑菌劑，并加入少量的吐溫80作增溶劑，以幫助樣品的充分分散。

?41℃厭氧培養(yǎng)有助于抑制其它雜菌生長。

2. 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）

?利用膽鹽來抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長；利用乳糖發(fā)酵，中性紅的顏色可把分解乳糖和不分解乳糖的細(xì)菌區(qū)分開。

?志賀氏菌呈無色菌落，半透明，光滑，濕潤，圓形，邊緣整齊或不齊。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)（MAC）

3.木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽（XLD）瓊脂培養(yǎng)基

?脫氧膽酸鈉可以抑制革蘭氏陽性細(xì)菌和部分大腸桿菌，多數(shù)志賀氏菌不能發(fā)酵木糖，木糖的添加可將志賀氏菌與其它菌株區(qū)別開來，因此，志賀氏菌在XLD平板上呈現(xiàn)無色菌落，但少數(shù)發(fā)酵木糖的志賀氏菌在此平板上會(huì)被漏檢，XLD平板對(duì)宋內(nèi)志賀氏菌亦有輕度抑制作用。

?志賀氏菌通常呈粉紅色至無色，半透明，光滑，濕潤，圓形，邊緣整齊或不齊菌落。

木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽（XLD）瓊脂菌落特征

4.志賀氏菌顯色培養(yǎng)基

?利用非志賀氏菌的特異性的酶，使其與酶底物結(jié)合形成不同顏色的菌落，而生化特性反應(yīng)不活躍的志賀氏菌經(jīng)22~28h培養(yǎng)后，則形成易于識(shí)別的白色-粉紅色（與培養(yǎng)基顏色相近）的菌落。

?志賀氏菌呈白色/清晰的菌落，大小約為1～3mm，周圍培養(yǎng)基變紅。

5.三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基

?該培養(yǎng)基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例為10:10:1，只能利用葡萄糖的細(xì)菌，葡萄糖被分解產(chǎn)酸使斜面先變黃，但因量少，生產(chǎn)的少量酸。因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌生長利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故斜面后來又變紅。底部由于厭氧狀態(tài)，酸類不被氧化，仍保持黃色。而發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，則產(chǎn)生大量的酸，使整個(gè)培養(yǎng)基呈黃色。另外，因某些細(xì)菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫和培養(yǎng)基中的鐵鹽反應(yīng)生成黑色的硫化亞鐵沉淀。

三糖鐵

6.靛基質(zhì)試驗(yàn)

?某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。

?結(jié)果判讀：陽性為滴加靛基質(zhì)試劑后液面立即變玫紅色； 陰性為滴加試劑后不變紅色。

靛基質(zhì)試驗(yàn)

7.尿素酶試驗(yàn)

?具有尿素酶的細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的尿素，產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)呈堿性，酚紅指示劑在pH6.8時(shí)呈黃色，pH8.1呈粉紅色。

?結(jié)果判讀：陽性為玫紅色； 陰性為淡橙紅色-淡黃色。

尿素酶試驗(yàn)

8.賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)

?具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺（賴氨酸→尸胺）和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿，使指示劑顯示出來。

?結(jié)果判讀：陽性為試驗(yàn)管為綠色-藍(lán)綠色，對(duì)照管變黃色； 陰性為試驗(yàn)管和對(duì)照管均變黃色，或均不變色。

賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性

9.糖（醇）發(fā)酵試驗(yàn)

?絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖（醇）類作為碳源和能源，但是它們在分解糖（醇）的能力上有很大的差異，有些細(xì)菌能分解某種糖（醇）并產(chǎn)酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來斷定。

?（指示劑為溴甲酚紫）結(jié)果判讀：陽性為變黃色； 陰性為紫色。

甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)

10.β-半乳糖苷酶

?某些細(xì)菌可產(chǎn)生b-半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚-b半乳糖苷（ONPG），生成黃色的鄰硝基酚。

?結(jié)果判讀：陽性為黃色； 陰性為不變色-淡黃色。

ONPG生化管

11.  葡萄糖銨試驗(yàn)

?鑒別細(xì)菌利用銨鹽作為唯一氮源并分解葡萄糖的試驗(yàn)。溴麝香草酚藍(lán)是指示劑，產(chǎn)酸時(shí)培養(yǎng)基由綠色變黃色。

?結(jié)果判讀：陽性為黃色； 陰性為綠色。

葡糖糖銨利用試驗(yàn)

12.  西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基

?細(xì)菌能利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源，能在除檸檬酸鹽外不含其他碳源的培養(yǎng)基上生長，分解檸檬酸鹽生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。

?結(jié)果判讀：陽性為藍(lán)綠-藍(lán)色； 陰性為綠色。

西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基試驗(yàn)

13.  粘液酸鹽試驗(yàn)

?某些細(xì)菌能利用粘液酸鹽，分解產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)變黃色。

?結(jié)果判讀：陽性為黃色； 陰性為綠色-藍(lán)綠色。

粘液酸鹽試驗(yàn)

四、志賀氏菌的生化鑒定

生化反應(yīng)

A群：痢疾志賀氏菌

B群：福氏志賀氏菌

C群：鮑氏志賀氏菌

D群：宋內(nèi)氏志賀氏菌

?-半乳糖苷酶

－a

－

－a

＋

尿素

－

－

－

－

賴氨酸脫羧酶

－

－

－

－

鳥氨酸脫羧酶

－

－

－b

＋

水楊苷

－

－

－

－

七葉苷

－

－

－

－

靛基質(zhì)

－/＋

(＋)

－/＋

－

甘露醇

－

＋c

＋

＋

棉子糖

－

＋

－

＋

甘油

(＋)

－

(＋)

d

注：+表示陽性；-表示陰性；-/+表示多數(shù)陰性；+/-表示多數(shù)陽性；（+）表示遲緩陽性；d表示有不同生化型。

a痢疾志賀1型和鮑氏13型為陽性。

b鮑氏13型為鳥氨酸陽性。

c福氏4型和6型常見甘露醇陰性變種。

?附加生化鑒定

?由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenic E.coil.）、A-D（堿性-異型Alkalescens-D isparbiotypes）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集。需要進(jìn)一步做葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(yàn)(36℃培養(yǎng)24 h～48 h)。

生化反應(yīng)

A群：痢疾志賀氏菌

B群：福氏志賀氏菌

C群：鮑氏志賀氏菌

D群：宋內(nèi)氏志賀氏菌

大腸埃希氏菌

A-D菌

 

葡萄糖銨

－

－

－

－

＋

＋

西蒙氏檸檬酸鹽

－

－

－

－

d

d

粘液酸鹽

－

－

－

d

＋

d

注1：+表示陽性；-表示陰性；d表示有不同生化型。

注2：在葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(yàn)三項(xiàng)反應(yīng)中志賀氏菌一般為陰性，而不活潑的大腸埃希氏菌、A-D（堿性-異型）菌至少有一項(xiàng)反應(yīng)為陽性。

 

五、志賀氏菌的血清診斷

?志賀氏菌屬?zèng)]有動(dòng)力，所以沒有鞭毛抗原。志賀氏菌屬主要有菌體（O）抗原。菌體O抗原又可分為型和群的特異性抗原。

?一般采用1.2%～1.5%瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原

?在玻片上劃出2個(gè)約1cm×2cm的區(qū)域，挑取一環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個(gè)區(qū)域下部加1滴抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對(duì)照。

?再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個(gè)區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動(dòng)混合1 min，并對(duì)著黑色背景進(jìn)行觀察，如果抗血清中出現(xiàn)凝結(jié)成塊的顆粒，而且生理鹽水中沒有發(fā)生自凝現(xiàn)象，那么凝集反應(yīng)為陽性。

?如果待測菌的生化特征符合志賀氏菌屬生化特征，而其血清學(xué)試驗(yàn)為陰性的話，可挑取菌苔于1mL生理鹽水做成濃菌液，100℃煮沸15 min～60 min去除K抗原后再檢查。

六、所需培養(yǎng)基試劑

用途

貨號(hào)

名稱

規(guī)格

增菌

023141

志賀氏菌增菌肉湯

瓶（干粉）250g

SR0380

志賀氏菌增菌肉湯配套試劑（新生霉素）

盒（西林瓶）10支/盒

CP0730

志賀氏菌增菌肉湯（需加配套試劑）

盒（袋裝）225 mL×10袋

平板分離

029999

木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂（XLD）

瓶（干粉）250g

029999P1

木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂（XLD）

瓶（顆粒）250g

CP0180

木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂（XLD）

盒（平板）90 mm×20

022144

麥康凱瓊脂

瓶（干粉）250g

024076

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板

盒（平板）90 mm×20

CRM011

志賀氏菌顯色培養(yǎng)基

1000mL

CRM011A

志賀氏菌顯色瓊脂平板

盒（平板）90 mm×20

生化鑒定

022080

三糖鐵瓊脂（TSI）

瓶（干粉）250g

CP0080

三糖鐵斜面

盒（管裝）20支

026050

半固體瓊脂

瓶（干粉）250g

075350A

半固體瓊脂

盒（管裝）20支

CP0150

營養(yǎng)瓊脂

盒（管裝）20支

024089

營養(yǎng)瓊脂平板

盒（平板）90 mm×20

022020

營養(yǎng)瓊脂

瓶（干粉）250g

022020P1

營養(yǎng)瓊脂(NA)

瓶（顆粒）250g

023090

尿素瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)

瓶（干粉）100g

029100

40%無菌尿素溶液

盒（西林瓶）10支/盒

生化鑒定

075150

尿素（凍干）

盒（西林瓶）10支/盒

075280

賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基

盒（西林瓶）20支/盒

075270

L-鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基

盒（西林瓶）20支/盒

075290

氨基酸脫羧酶對(duì)照培養(yǎng)基

盒（西林瓶）20支/盒

029110

無菌石蠟油

10 mL×1支

075180

β-半乳糖苷ONPG

盒（西林瓶）20支/盒

075140

水楊素（水楊苷）

盒（西林瓶）20支/盒

075160

七葉靈（七葉苷）

盒（西林瓶）20支/盒

075040

甘露醇

盒（西林瓶）20支/盒

075230

D-棉籽糖

盒（西林瓶）20支/盒

生化鑒定

022110

蛋白胨水(靛基質(zhì)培養(yǎng)基，色氨酸肉湯)

瓶（干粉）100g

075240

蛋白胨水(靛基質(zhì)培養(yǎng)基，色氨酸肉湯)

盒（西林瓶）20支/盒

029230

靛基質(zhì)試劑

10 mL×1支

075840

甘油發(fā)酵管

盒（西林瓶）20支/盒

075260

葡萄糖銨

盒（西林瓶）20支/盒

023150

葡萄糖銨培養(yǎng)基

瓶（干粉）250g

075200

西蒙氏檸檬酸鹽

盒（西林瓶）20支/盒

022120

西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基

瓶（干粉）250g

075521

粘液酸鹽測試肉湯

盒（西林瓶）20支/盒

075522

粘液酸鹽質(zhì)控肉湯

盒（西林瓶）20支/盒