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更新 | GB4789.10-2016金黃色葡萄球菌檢驗及其注意事項

發(fā)布時間：2024-06-12      瀏覽次數(shù)：2734    分享：

金黃色葡萄球菌的生物學特性

生物學特性：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，直徑0.4～1.2μm，呈葡萄串狀排列；無鞭毛、無芽胞；在陳舊培養(yǎng)物中，衰老的菌體常轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。兼性厭氧菌，最適生長溫度37°C，最適生長pH7.4；耐鹽性強，可產(chǎn)黃色色素。

金黃色葡萄球菌生物學特性

流行學特征：金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌，廣泛存在于自然環(huán)境中。金黃色葡萄球菌在適當?shù)臈l件下，能夠產(chǎn)生腸毒素，引起食物中毒。近幾年，金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒報道層出不窮，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的 25%左右，金黃色葡萄球菌成為僅次于沙門氏菌和副溶血桿菌的第三大微生物致病菌。

金黃色葡萄球菌流行學特征

金黃色葡萄球菌的檢驗

第一法：定性檢驗

金黃色葡萄球菌定性檢驗

操作注意事項

1：使用均質(zhì)袋進行前增菌時，應使用帶有底托的均質(zhì)袋架子，防止培養(yǎng)過程中前增菌袋子歪倒泄漏污染培養(yǎng)箱；
2：高壓滅菌后，培養(yǎng)基中瓊脂往往會分層在底部，應搖勻使用；
3：金黃色葡萄球菌在血平板上大部分為金黃色，但有時為白色色，形態(tài)鑒定時需注意；
4：如果BP平板在培養(yǎng)48小時后未見金黃色葡萄球菌可疑菌落，應挑取非典型菌落進行鑒定；
5：金黃色葡萄球菌在BP平板上有時可見到不分解脂肪的菌株，除每一偶不透明圈和清晰帶外，其他外觀基本相同。此外，從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落，其黑色常較典型菌落淺些，其外觀可能較粗糙，質(zhì)地較干燥。形態(tài)鑒定時需特別注意；
6：培養(yǎng)箱中疊放培養(yǎng)皿時，為防止中間平皿過熱，高度不得超過6個平板；

第二法：平板計數(shù)法 第三法：MPN法
金黃色葡萄球菌平板計數(shù)法 金黃色葡萄球菌MPN法

操作注意事項

1：在進行樣本10倍稀釋的過程中，吸管應插入檢樣稀釋液液面2.5cm以下，取液應先高于1mL，而后將吸管尖端貼于試管內(nèi)壁調(diào)整至1mL，這樣操作不會有過多的液體粘附于試管外。而后將1mL液體加入另一9mL試管內(nèi)時應沿管壁加入，不要觸及管內(nèi)稀釋液晶，以防吸管外部粘附的液體混入其中影響實驗結(jié)果。

培養(yǎng)基原理解析

1、7.5%氯化鈉肉湯

? 蛋白胨和牛肉膏粉提供碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)；較高含量的氯化鈉提供較高的滲透壓，抑制大多數(shù)非葡萄球菌的微生物。

7.5%氯化鈉肉湯

2、Baird-Parker瓊脂
? 胰蛋白胨、牛肉膏粉和酵母膏粉提供碳氮源、維生素和生長因子；丙酮酸鈉和甘氨酸刺激葡萄球菌的生長；氯化鋰和亞碲酸鉀抑制非葡萄球菌的微生物；含有卵磷脂酶的葡萄球菌降解卵黃使菌落產(chǎn)生透明圈，而脂酶作用則產(chǎn)生不透明的沉淀環(huán)；凝固酶陽性的葡萄球菌還能還原亞碲酸鉀而產(chǎn)生黑色菌落。
? 金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圓形, 表面光滑、 凸起、 濕潤、 菌落直徑為2 mm~3 mm,顏色呈灰黑色至黑色, 有光澤, 常有淺色(非白色) 的邊緣, 周圍繞以不透明圈( 沉淀) , 其外常有一清晰帶。

金黃色葡萄球菌菌落黑色，周圍具有不透明圈，其外有清晰帶

金黃色葡萄球菌菌落黑色，周圍具有不透明圈，其外有清晰帶

3、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基
? 原理：顯色劑與金黃色葡萄球菌具有的酶發(fā)生特異性反應，水解底物，釋放出顯色基團，在無色透明平板上，金黃色葡萄球菌產(chǎn)生粉紅－紫紅的邊緣整齊菌落；抑菌劑可抑制雜菌的生長。
? 特點：使用方便，加熱煮溶即可不需高壓滅菌；結(jié)果顏色清楚，結(jié)果一目了然。

金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基

4、BHI肉湯
? 胰蛋白質(zhì)胨和牛心浸出液提供氮源、維生素和生長因子；葡萄糖可為多種細菌提供能源；氯化鈉維持均衡的滲透壓；磷酸氫二鈉為緩沖劑。

BHI肉湯

 

5、血平板
? 酪蛋白胰酶消化物、心胰酶消化物、肉胃酶消化物、酵母浸出粉、可溶性淀粉提供碳氮源、維生素和生長因子；羊血是細菌生長繁殖的良好營養(yǎng)物質(zhì)。在45～50℃的基礎培養(yǎng)基中加入血液可以保存血液中某些不耐熱的生長因子，同時血球不被破壞。
? 金黃色葡萄球菌菌落為金黃色，菌落周圍可見完全透明溶血圈。

金黃色葡萄球菌黃色或白色菌落，有完全透明溶血圈

 金黃色葡萄球菌黃色或白色菌落，有完全透明溶血圈

HandyPlate 金黃色葡萄球菌測試片

金黃色環(huán)凱葡萄球菌測試片與3M方法擬合度良好
金黃色葡萄球菌測試片
金黃色葡萄球菌測試片與3M方法擬合度良好金黃色葡萄球菌測試片

金黃色葡萄球菌顯品 - 紫紅色菌落

測試片性能驗證

金黃色葡萄球菌測試片性能驗證

生化鑒定原理解析

1、血漿凝固酶試驗
? 致病性的金葡菌產(chǎn)生的血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w蛋白，附著于細菌表面，產(chǎn)生凝固。
? 如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，判定為陽性結(jié)果。
? 必須注意，某些菌株在產(chǎn)生的葡激酶在延長孵育時間后可使凝塊溶解使之產(chǎn)生假陰性。

血漿凝固酶試驗

金黃色葡萄球菌實時熒光PCR快檢法

金黃色葡萄球菌實時熒光PCR快檢法

金黃色葡萄球菌實時熒光PCR擴增試劑盒

? 技術原理：基于實時熒光PCR技術，針對檢測目標特異性基因片段設計引物和熒光探針并優(yōu)化反應所需試劑組分，加入待檢樣品核酸即可進行擴增反應。在擴增過程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號，此時熒光定量PCR儀可識別該熒光信號，同時根據(jù)其強弱變化繪制出相應的實時擴增曲線，進而判定目標基因是否檢出。
? 產(chǎn)品優(yōu)勢：快速提取，一步法核酸提取，快速高效，核酸提取效率高；操作簡單，提供PCR反應體系預混液，直接加樣檢測，無需自行配制；特異性強，采用高特異性引物及探針，確保實驗準確性；靈敏度高，采用高效的擴增酶，檢測靈敏度可達10-100copies/test。
? 產(chǎn)品組成：

組分名稱

規(guī)格×數(shù)量

預混液

1mL × 1管

陽性對照

200μL × 1管

陰性對照

200μL × 1管

裂解液

1mL × 2管

說明書

1份

質(zhì)量控制及疑難解析

質(zhì)量控制

1、實驗室過程中，每批預增菌液、選擇性增菌液、分離平板等都要做空白對照。以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。

2、定期使用金黃色葡萄球菌ATCC6538或相應定量活菌參考品，在P2實驗室或陽性對照實驗室內(nèi)，用適當?shù)氖称窐悠愤M行陽性實驗驗證，污染劑量應控制在10-100CFU/25g，并進行記錄，驗證實驗至少每2個月進行1次。

3、每2個月將所使用的培養(yǎng)基和生化試劑用金黃色葡萄球菌的標準菌株或陰性菌株進行驗證，并進行記錄。

定量菌株

疑難解析

問：在增菌增菌結(jié)束后，肉湯未見微生物生長，是否可以終止實驗？
答：不可以，因為肉湯可見的細菌濃度為107CFU/ml，在此濃度一下，肉眼不能發(fā)現(xiàn)微生物生長，但實際溶液中有微生物生長。

問：金黃色葡萄球菌溶血屬于哪種類型?
答：細菌溶血的類型可分為三種，ɑ溶血，β溶血和γ溶血。γ溶血即為不溶血， ɑ溶血和β溶血都出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，但區(qū)別在于ɑ溶血環(huán)中的紅細胞未完全溶解，而β溶血環(huán)中的紅細胞完全溶解，因此會出現(xiàn)透明的溶血環(huán)，金黃色葡萄球菌引起的溶血屬于β溶血。 

所需培養(yǎng)基試劑

用途

貨號

名稱

規(guī)格

稀釋

CP0310

生理鹽水

9mL×20支

增

菌

024010

7.5%氯化鈉肉湯

250g/瓶

024010P1

7.5%氯化鈉肉湯

250g/瓶

CP0700

7.5%氯化鈉肉湯

225mL×10袋

平

板

分

離

024040

Baird-Parker瓊脂基礎

250g/瓶

029190

卵黃亞碲酸鉀增菌液

Baird-Parker瓊脂配套試劑

2.5mL×10支

029192

卵黃亞碲酸鉀增菌液

Baird-Parker瓊脂配套試劑

25mL×6支

024040A

Baird-Parker瓊脂平板

90mm×20個

024070

血平板

90mm×20個

CRM012

金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基

1000mL/瓶

CRM012A

金黃色葡萄球菌

顯色培養(yǎng)基平板

90mm×20個

純

培

養(yǎng)

024053

腦心浸出液肉湯(BHI)

250g/瓶

024053A

腦心浸出液肉湯(BHI)

10mL×20支

022020

營養(yǎng)瓊脂

250g/瓶

022020P1

營養(yǎng)瓊脂

250g/瓶

CP0150

營養(yǎng)瓊脂斜面

8.5mL×20支

生化鑒定

029180

凍干血漿

10支/盒

KJD04L

金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒（恒溫熒光法）

24test

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GB4789.10

 

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