據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，致病菌是引發(fā)食源性疾病的主要因素，占比高達(dá)70%。而食源性致病菌易通過食品生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)對(duì)以肉、蛋、奶及其制品為代表的動(dòng)物性食品造成污染。因此，食源性致病菌的早期篩查和超靈敏檢測(cè)是保障食品安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。基于新型Argonaute(Ago)酶實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性致病菌的“火眼金睛”識(shí)別，豐富了超靈敏檢測(cè)細(xì)菌的工具箱。
傳統(tǒng)的食源性致病菌的檢測(cè)方法
前食源性致病菌的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法、核酸擴(kuò)增方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、重組酶聚合酶擴(kuò)增 (RPA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、免疫學(xué)方法等。然而，這些方法受限于流程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、依賴大型儀器、缺乏終點(diǎn)檢測(cè)、攜帶污染、非特異性擴(kuò)增等。
新型Ago酶的出現(xiàn)
Ago酶作為一種程序性、靶激活的核酸酶，是一種高度保守的蛋白，在真核生物和原核生物中都具有防御和調(diào)節(jié)功能。Ago酶可以使用互補(bǔ)的單鏈“向?qū)NA(gDNA)”或基于Watson-Crick堿基配對(duì)的“gDNA”來切割侵襲性RNA或DNA。真核Ago酶 (eAgos)主要參與RNA干擾，而原核Ago酶 (pAgos)主要通過DNA干擾參與宿主防御。pAgo的識(shí)別和切割是由DNA或RNA引導(dǎo)的，但不限于目標(biāo)中的PAM序列。
基于Ago酶的“火眼金睛”如何精準(zhǔn)識(shí)別食源性致病菌？
首先研究人員利用標(biāo)簽特異性引物實(shí)現(xiàn)對(duì)傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物會(huì)作為阿爾戈瑙熱球菌Ago（Pyrococcus furiosus Argonaute, PfAgo酶的gDNA，從而可以促進(jìn)PfAgo酶識(shí)別并切割兩端分別連接有熒光信號(hào)和熒光猝滅劑的基因，使得熒光信號(hào)迅速增強(qiáng)，從而可以通過“火眼金睛”快速識(shí)別熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性致病菌的定量監(jiān)測(cè)。
基于Ago酶的“火眼金睛”的食源性致病菌精準(zhǔn)識(shí)別的優(yōu)勢(shì)
如圖一所示，基于Ago酶的“火眼金睛”的食源性致病菌精準(zhǔn)識(shí)別是通過結(jié)合tag特異性引物，核酸外切酶(Exo I)和PfAgo，在沒有引入多個(gè)gDNA的情況下進(jìn)行的一步切割。此外，Tag序列和報(bào)告基因具有通用性和無重構(gòu)性。其他食源性致病菌的檢測(cè)只需設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物即可。方案1B和1C顯示了以往基于ago的檢測(cè)和基于pcr的檢測(cè)的一般原理，則沒有該方法的優(yōu)勢(shì)。
Figure 1. Schematic diagram of the proposed NOTE-Ago assay based on PfAgo system (A), previous Ago-based detection (B) and PCR-based detection (C).
關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)
● 基于Ago酶的“火眼金睛”的食源性致病菌精準(zhǔn)識(shí)別將tag特異性引物和PfAgo相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等食源性致病菌的超敏感檢測(cè)
● 基于Ago酶的“火眼金睛”的食源性致病菌精準(zhǔn)識(shí)別具有在多重病原菌中區(qū)分檢測(cè)靶點(diǎn)的能力。
研究前景：
這項(xiàng)研究擴(kuò)展了基于Ago酶的檢測(cè)工具箱，提出了一種新型的、無需重建的食源性致病菌檢測(cè)平臺(tái)，具有簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，并具有多重檢測(cè)的潛力。參考來源：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2023.131485
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~高翔。
