從國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)了解單增李斯特菌新型檢測(cè)方法
發(fā)布時(shí)間：2024-09-04 瀏覽次數(shù)：353
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是一種人畜共患病的病原菌，感染會(huì)造成敗血癥、腦膜炎、胃腸炎等李斯特菌病，嚴(yán)重還會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)甚至造成孕婦流產(chǎn)，被世界衛(wèi)生組織定為四大食源性細(xì)菌之一，所以關(guān)于單增李斯特菌的檢測(cè)與控制顯得尤為重要。傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢測(cè)方法(國(guó)標(biāo)GB4789.30-2016 )包括增菌、分離、鑒定三部分(圖一)，整個(gè)定性過程大約需要1周時(shí)間。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與實(shí)際需求，越來越多靈敏、快速的單增李斯特菌檢測(cè)方法被發(fā)現(xiàn)，不斷有新技術(shù)被納入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，例如：環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增、微滴式數(shù)字PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、酶聯(lián)免疫法、免疫磁珠法以及PCR-試紙條法。
圖一：GB4789.30-2016
一、環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增(SN/T5367.1—2022)
用環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的篩選檢測(cè)是根據(jù)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌屬特有靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，采用6條特異引物通過穩(wěn)定的Bst DNA 聚合酶來驅(qū)動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)，在60 ℃左右完成恒溫?cái)U(kuò)增。在環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)中,焦磷酸鹽(PPi)通過ATP-硫酸化酶被轉(zhuǎn)化成三磷酸腺苷(ATP)。熒光素酶利用ATP發(fā)光，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)。
圖二：SN/T5367.1—2022
二、微滴式數(shù)字PCR(SN/T5364.6—2021)
微滴式數(shù)字PCR是針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌溶血素(hly)基因片段設(shè)計(jì)引物、探針，將一定濃度的引物、探針與模板DNA 及數(shù)字PCR 反應(yīng)預(yù)混液混合，配成PCR 反應(yīng)體系。將該數(shù)字PCR 體系分布到10 000~20 000個(gè)微滴中，使大部分微滴中模板DNA 分子的數(shù)量為1或0，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。hly 基因探針5’端標(biāo)記FAM 熒光基團(tuán)，利用數(shù)字PCR 系統(tǒng)的檢測(cè)通道，可對(duì)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)進(jìn)行采集分析。含有模板DNA 的微滴出現(xiàn)熒光信號(hào)的增強(qiáng)，形成陽性微滴簇。根據(jù)陽性微滴的有無判定樣品中是否含有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。
圖三：SN/T5364.6—2021
三、酶聯(lián)免疫法(GB/T22429-2008)
將做增菌處理后的增菌液經(jīng)加熱處理后移入包被特異性抗體(一抗)的固定容器中內(nèi)，使目標(biāo)菌與一抗結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他成分后加入特異性酶標(biāo)抗體(二抗)，再次洗去未結(jié)合的其他成分，加入特定底物與之反應(yīng)后可以生成熒光化合物或有色化合物，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度或吸光度，與參照值比較即可得到檢驗(yàn)結(jié)果。
圖四：GB/T22429-2008
四、免疫磁珠法(SN/T0184.3-2008)
免疫磁珠法是將直徑0.05um～4um具有磁性的微珠的表面化學(xué)修飾，并與李斯特氏菌特異性抗體結(jié)合，制成免疫磁珠，它能與食品中李斯特氏菌抗原結(jié)合，從而檢出食品中的李斯特氏菌。樣品經(jīng)24～48h增菌后，分別取1mL增菌液和20ul免疫磁珠加入帶蓋塑料管中，在磁板背景下混合，如果有李斯特氏菌抗原存在，免疫磁珠就會(huì)將其捕獲，然后利用磁性將免疫磁珠聚集，經(jīng)清洗后接種到顯色培養(yǎng)基和任選一種培養(yǎng)基(OXA 或PALCAM瓊脂)，對(duì)于選擇性分離平板上典型李斯特氏菌菌落進(jìn)行確認(rèn)，最終通過系列試驗(yàn)確定是否存在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。
圖五：SN/T0184.3-2008
五、PCR-試紙條法(SN/T5439.7—2022)
對(duì)樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行增菌培養(yǎng)后提取DNA，采用上游和下游引物分別經(jīng)地高辛和異硫氰酸鹽標(biāo)記的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的特異性檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。檢測(cè)用試紙條上含有金標(biāo)記的抗異硫氰酸鹽的抗體，可與PCR產(chǎn)物上的異硫氰酸鹽標(biāo)記分子結(jié)合，在檢測(cè)線位置上有抗地高辛抗體，可與PCR產(chǎn)物上的地高辛標(biāo)記分子結(jié)合，從而顯色。如模板未擴(kuò)增，則無PCR 產(chǎn)物與地高辛抗體及FITC抗體結(jié)合，從而不能在檢測(cè)線(T線)位置顯示顏色。
圖六：SN/T5439.7—2022
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~李穎
