稀釋涂布平板法計數菌落數的操作及注意事項
發(fā)布時間：2024-07-24 瀏覽次數：4042
01、稀涂布平板法操作步驟
稀釋涂布平板法是一種常用的微生物數量測定方法，它通過將樣品進行一系列稀釋，然后將不同稀釋度的菌液涂布到固體培養(yǎng)基表面，經過培養(yǎng)后，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，從而估算原始樣品中的活菌數量。具體步驟如下：
1）實驗室準備：確保實驗室環(huán)境清潔、干燥、無塵、無霉菌，操作臺、器皿、試劑應清洗干凈并消毒處理。實驗室應備有必要的設備和器具，如移液器、量筒、加熱器、平板計數器等。實驗人員應穿戴干凈、無菌的實驗服裝和手套。
2）樣品處理：選擇代表性、均勻的樣品，并按照要求采集。樣品應在規(guī)定時間內送達實驗室，盡快進行處理。樣品應在處理前進行預處理，如過濾、破碎、稀釋等。
3）平板制備：準備平板和培養(yǎng)基，根據需要配置適當的培養(yǎng)基（不同微生物需要選擇不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基）。將平板培養(yǎng)基加熱至沸騰，然后冷卻至適宜的溫度（通常為45-50℃）。將冷卻好的培養(yǎng)基均勻地倒入空平板中，使其均勻分布在整個平板上，根據平板的大小，傾倒至培養(yǎng)基厚度約為0.5cm左右即可。除了自己倒平板外也可以使用商品化成品固體培養(yǎng)基。
4）稀釋涂布：先稀釋后涂布。將待測樣品進行一系列梯度稀釋，一般情況下10倍、100倍、1000倍等稀釋。將不同稀釋程度的菌液分別涂布到固體培養(yǎng)基的表面，隨后將平板平放于實驗臺上15-20min,使菌液滲透并固化，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（通常培養(yǎng)24-48h）。
5）菌落計數：培養(yǎng)后，統(tǒng)計菌落數目，計算出樣品中的含菌數。計數原則：平板上菌落數30-300之間為合格。如果只有一個稀釋度的平均菌落數符合要求，則以該稀釋度平均菌落數除以涂布平板所用稀釋液體積（0.1mL），乘以稀釋倍數作為該樣品的細菌總數。如果有兩個稀釋度的平均菌落數符合要求，則按照兩者菌落總數之比來決定，如果小于2，取兩者的平均值；如果大于2，取較小的菌落總數。
02、稀涂布平板法注意事項
① 整個過程需要保證在無菌條件下進行，以防止雜菌污染。
② 注意稀釋液的準確性，避免誤差。稀釋比例應該根據菌液的濃度進行調整，通常使用10倍系列稀釋法進行稀釋。如果菌液濃度較高，可以采用更大稀釋比例，以避免平板上出現過多的菌落。
③ 涂布平板時要均勻一致，以保證菌落計數的準確性。涂布時可以采用涂抹、劃線或點植等方法，具體方法應根據實驗要求和培養(yǎng)基性質選擇。
④ 在計數時要選擇菌落數穩(wěn)定且分布均勻的平板進行計數，避免誤差。
⑤ 在進行稀釋涂布平板法時，需要保證實驗的重復性。每個實驗應該設置多個重復組（通常一個稀釋度進行3-5次重復），以避免實驗結果的偶然性和誤差。
⑥ 在稀釋過程中，要注意取液量要準確，并且每次稀釋后，要將稀釋液混合均勻，再進行下一步稀釋。
⑦ 無論是涂布還是傾注接種，都要讓微生物分布均勻，且盡量靠近中間，遠離邊緣，因為菌落生長在邊緣時，不容易讀取，且易連成片。
⑧ 設置對照，以排除操作過程中可能的污染。
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