一、藥敏試驗(yàn)中相關(guān)概念

1.CLSI?：The Clinical and Laboratory Standards Institute，簡稱CLSI，其前身是NCCLS。CLSI標(biāo)準(zhǔn)包括抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(M3-A)，其中包括了各類抗菌藥物的敏感性和耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)，感興趣的友友可以去官網(wǎng)查看。

2.MIC：Minimal Inhibitory Concentration，最低抑菌濃度，能夠抑制受試菌生長的最低抗生素濃度。它反映了細(xì)菌對藥物的敏感性，是衡量藥物抑制細(xì)菌生長能力的指標(biāo)。通常情況下，MIC大于等于MBC，這意味著藥物在達(dá)到抑制細(xì)菌生長的濃度時(shí)，通常也具備了殺滅細(xì)菌的能力。

3.MBC：Minimal Bactericidal Concentration，最小殺菌濃度，指殺死99.9%（降低3個(gè)數(shù)量級）的受試菌所需的最低藥物濃度。這一指標(biāo)用于評估抗菌藥物的效果，確保藥物能夠有效殺滅大部分細(xì)菌，從而保護(hù)患者免受感染。

4.MIC50：在一批實(shí)驗(yàn)中，能夠抑制50%受試菌所需的最小抑菌濃度。它提供了一個(gè)基準(zhǔn)點(diǎn)，表明了藥物在多大程度上能夠影響細(xì)菌群體的一半。

5.MIC90：能夠抑制90%受試菌所需的最小抑菌濃度。這表明了藥物在更大范圍內(nèi)的有效性，即它能夠在多大程度上影響細(xì)菌群體的絕大部分。

注意：顏色代表抗菌藥物的濃度，藍(lán)色圓球代表菌濃。該圖僅供模擬數(shù)據(jù)，不具有實(shí)際意義。

比如說，第1-7支試管中，無受試菌生長，說明受試菌生長受到抑制或被殺死，第7號試管中抗菌藥物濃度即是最小抑菌濃度MIC ，是一個(gè)具體濃度值，每次試驗(yàn)都有一個(gè)MIC值。

MIC50和MIC90：是統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)，測定多個(gè)受試菌的MIC值，然后將這些MIC值從小到大排序，找到排在中間位置的MIC值，即為MIC50，同理抑制90%受試菌生長的濃度即為MIC90。

但，這些數(shù)據(jù)都是大量數(shù)據(jù)得出的結(jié)論，絕不能只是單次試驗(yàn)結(jié)果。

二、紙片擴(kuò)散法和稀釋法的異同

前面一節(jié)我們學(xué)習(xí)了微生物藥敏試驗(yàn)（一）：紙片擴(kuò)散法，這一節(jié)繼續(xù)學(xué)習(xí)微生物藥敏試驗(yàn)（二）：稀釋法，先了解一下二者異同。

兩種方法都是藥敏試驗(yàn)常用方法，目標(biāo)相同、原理相似、操作步驟和結(jié)果評估都相似，是相似但不是相同。

1.操作方法不同

紙片擴(kuò)散法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了受試菌的瓊脂表面上，觀察受試菌的生長情況或抑菌圈大小；而稀釋法是用MH肉湯將抗菌藥物進(jìn)行一系列稀釋后，然后添加受試菌，觀察受試菌生長情況。

2.表現(xiàn)形式不同

紙片擴(kuò)散法是隨著抗菌藥物擴(kuò)散距離的增加抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成一種透明圈；而稀釋法是抑制受試菌肉眼可見生長的最低藥物濃度，即為該藥物對受試菌的最低抑菌濃度(MIC）。

3.研究性質(zhì)不同

紙片擴(kuò)散法是定性藥敏試驗(yàn)，簡便易行，適用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用；稀釋法是定量藥敏試驗(yàn)，可確定受試菌對某抗菌藥物的MIC和MBC。

因此，稀釋法可作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，特別是瓊脂稀釋法被譽(yù)為金標(biāo)準(zhǔn)。

三、稀釋法原理?

將一定濃度的抗菌藥物進(jìn)行一系列對倍稀釋后，接種受試菌株，經(jīng)孵育后觀察細(xì)菌生長情況，分析藥敏結(jié)果，可定量檢測該抗菌藥物的最低抗菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）、可抑制50%受試菌的MIC（MIC50）、可抑制90%受試菌的MIC（MIC90）。此法較少應(yīng)用于臨床檢測，多用于耐藥的調(diào)查。

四、肉湯稀釋法操作步驟

稀釋法藥敏試驗(yàn)主要有試管肉湯稀釋法、微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法等方法，其主要區(qū)別為培養(yǎng)基狀態(tài)和含量不同，但試驗(yàn)步驟基本一致。我們這里學(xué)習(xí)一下試管肉湯稀釋法。

1.抗菌藥物稀釋
按照CLSI制訂的指南進(jìn)行抗菌藥物原液制備和稀釋。比如，抗菌藥物溶劑的選擇，pH調(diào)節(jié)，稀釋液的選擇等。

2.受試菌菌液制備
挑取活化好的受試菌制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙骸?/span>

3.菌株接種
配制好菌懸液后，在15min內(nèi)接種完成。
按照試管肉湯稀釋法和微量肉湯稀釋法最終接種菌量為10⁵CFU/mL，瓊脂稀釋法最終接種菌量為10⁴CFU/mL進(jìn)行接種。

4.孵育
接種完畢后，將試管放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~20h。
不同的微生物培養(yǎng)時(shí)間不同。

5.結(jié)果分析
檢查對照組生長情況，用肉眼觀察或比濁法讀取數(shù)據(jù)。

五、稀釋法在普通微生物實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用實(shí)例

1.菌種
大腸桿菌受試菌種，大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.培養(yǎng)基和試劑
按照CLSI制訂的指南進(jìn)行抗菌藥物原液制備。
按照配方配制MH液體培養(yǎng)基。

3.菌液制備
采用劃線法將大腸桿菌受試菌種和標(biāo)準(zhǔn)菌種接種于營養(yǎng)瓊脂平板，35℃培養(yǎng)16-18h，然后挑取單菌落，重懸于3mL無菌生理鹽水中，混勻后與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁。調(diào)整濁度與標(biāo)準(zhǔn)比濁管0.5麥?zhǔn)舷嗤褂们跋♂?00倍。

4.準(zhǔn)備試管
準(zhǔn)備15支無菌試管，標(biāo)記1-1—1-15。
另取15支無菌試管，標(biāo)記2-1—2-15。

5.添加稀釋培養(yǎng)基
用移液器向每管中加入1mLMH液體培養(yǎng)基。

6.抗菌藥物對倍稀釋
吸取抗菌藥物原液1mL至第1支試管中，混勻；從第1支試管中取出1mL加入第2支試管中，混勻；依次對倍稀釋，直到第13支試管，混勻。
兩組1-13試管處理一致。

7.加入受試菌和標(biāo)準(zhǔn)菌菌懸液
1-1—1-14管中加入受試菌1mL，混勻，第14管作對照組（沒有抗菌藥物，只有培養(yǎng)基和受試菌），第15管作空白對照（只有培養(yǎng)基）。
2-1—2-14管中加入標(biāo)準(zhǔn)菌1mL，混勻，第14管作對照組（沒有抗菌藥物，只有培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)菌），第15管作空白對照（只有培養(yǎng)基）。

8.培養(yǎng)
將各試管放入35℃恒溫箱中培養(yǎng)12-18h。

9.觀察
檢查空白對照組中是否污染、對照組受試菌生長情況，顯微鏡看觀察對照組是否污染雜菌。

10.結(jié)果
空白對照組無污染、對照組受試菌生長良好且無污染，即可進(jìn)行篩選MIC。

(1)觀察法：通過觀察，抗菌藥物最低濃度管無細(xì)菌生長，即為受試菌的最低抑菌濃度（MIC）。
多次試驗(yàn)后，根據(jù)前面我們提到的相關(guān)概念方法中，找出MIC50和MIC90，尤其是MIC90。

(2)比濁法：使用可見分光光度計(jì)測定各管的濁度（通常在波長為600nm處進(jìn)行檢測），空白對照組（未加菌液）作對照，接近為0的最低藥物濃度即為MIC。

五、其他稀釋法

1.微量稀釋法
微量稀釋法使用的不是試管，是96孔板，比如說每個(gè)孔中加入200μLMH培養(yǎng)基，然后第1個(gè)孔中加入200μL抗菌藥物原液，混勻，依次對倍稀釋，混勻。加入10μL受試菌菌懸液，混勻，培養(yǎng)。

2.瓊脂稀釋法
瓊脂稀釋法用到的培養(yǎng)基是瓊脂培養(yǎng)基?？咕幬锝?jīng)一系列對倍稀釋后，瓊脂培養(yǎng)基融化至合適溫度（比如45℃），不同梯度抗菌藥物與瓊脂培養(yǎng)基的混合（通常為1:9），最后將混合好的含抗菌藥物瓊脂培養(yǎng)基迅速傾倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中（通常厚度為4mm）。

值得注意的是，在瓊脂稀釋法中，接種使用的是點(diǎn)接種不是涂布平板。即：使用多點(diǎn)接種器或無菌吸管等工具，吸取制備好的菌液（約1μL），在瓊脂表面點(diǎn)接菌，直徑約8mm。

六、注意事項(xiàng)

1.保證抗菌藥物質(zhì)量
抗菌藥物應(yīng)從正規(guī)機(jī)構(gòu)購買，已知效價(jià)和純度，按照說明書進(jìn)行保存，配制好的液體過濾除菌。

2.保證受試菌質(zhì)量
按照要求，嚴(yán)格分離受試菌，受試菌合格的標(biāo)本才能獲得合格的結(jié)果。取樣、檢查過程中，要進(jìn)行嚴(yán)格無菌操作，保證標(biāo)本清潔。

3.培養(yǎng)基的要求
不同微生物需要不同的培養(yǎng)基，特殊微生物還需要添加特殊的試劑。

4.結(jié)果分析
試驗(yàn)結(jié)果可能會出現(xiàn)跳孔現(xiàn)象，就是某一個(gè)抗菌濃度試管中不長菌，前后兩個(gè)梯度都長菌的情況，遇到這種情況首先需要檢查測試菌的純度，其次檢查抗菌藥物是否加錯，總之，重做試驗(yàn)是躲不過啦。

文章來源：環(huán)凱轉(zhuǎn)載于“ 微生物知識庫”公眾號；原標(biāo)題：“微生物藥敏試驗(yàn)（二）：稀釋法”；作者~發(fā)酵菌人。
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